§ 67. Селекция микроорганизмов

1. Какие организмы относят к микроорганизмам?

Ответ. Микрооргани́змы, (микро́бы) — название собирательной группы живых организмов, которые слишком малы для того, что бы быть видимыми невооружённым глазом (их характерный размер — менее 0,1 мм) . В состав микроорганизмов входят как безъядерные (прокариоты) , так и эукариоты: бактерии, некоторые грибы, археи, протисты, но не вирусы, которые обычно выделяют в отдельную группу. Большинство микроорганизмов состоят из одной клетки, но есть и многоклеточные микроорганизмы. Изучением этих организмов занимается наука микробиология.

2. Какие способы размножения характерны для микроорганизмов?

Ответ. Сложные процессы метаболизма, происходящие в клетке, отражаются такими явлениями, как рост и размножение микроорганизмов. Термин «рост» означает увеличение массы клеток микроорганизмов в результате синтеза клеточного материала. Интенсивность роста микроорганизмов можно определить делением их массы на численность особей в единице объема в отдельные промежутки времени. Рост индивидуальной клетки заканчивается размножением. Под размножением микробов подразумевают способность их к самовоспроизведению, т. е. увеличению количества особей микробной популяции на единицу объема. Отдельные группы микроорганизмов размножаются различными способами. У бактерий преобладает деление, может быть почкование. Грибы размножаются при помощи спор, вегетативным способом (участками мицелия), половым путем и почкованием (дрожжи). Вирусы размножаются путем репродукции вирусных частиц внутри клетки- хозяина.

Прокариотические клетки размножаются путем прямого (поперечного) деления. В процессе роста в клетках начинает нарастать количество общего азота, РНК и ДНК. Нуклеоид увеличивается в объеме, и в точках прикрепления к цитоплазматической мембране двухцепочечная ДНК под действием ферментов разрывается по водородным связям. Происходят репликация ДНК и синтез комплементарных вторичных цепочек, которые расходятся по полюсам клетки. Они в дальнейшем станут нуклеоидами дочерних клеток.

После деления нуклеоида начинается образование поперечной двухслойной перегородки, которая формируется за счет цитоплазматической мембраны. Различают изоморфное и гетероморфное деления клеток. При изоморфном делении перегородка формируется на середине клетки, в результате чего образуются две одинаковые по величине клетки. В некоторых случаях деление носит асимметричный характер, при котором дочерняя клетка отделяется от одного из концов бактерии и новые клетки имеют неодинаковую величину. Такое деление называют гетероморфным. Оно может наблюдаться в старых культурах, после обработки микроорганизмов малыми дозами пенициллина, некоторыми химическими веществами, при ультрафиолетовом облучении и воздействии других факторов. В результате такого воздействия происходит нарушение координации между ростом и делением клетки, в результате чего бактерия увеличивается, а деление ее не осуществляется.

Разделившиеся клетки могут отделяться одна от другой или оставаться рядом, формируя дипло- или стрептобактерии, стрептококки, стафилококки и сарцины. Это зависит от характера распределения слизистого слоя вокруг разделившейся клетки, от свойств питательной среды и др. У большинства бактерий делящая перегородка располагается, как правило, перпендикулярно длине, у кокков - в любой плоскости. У спирохет в редких случаях перегородка может располагаться и вдоль клетки. Бактерии характеризуются высоким темпом размножения, который обусловлен небольшим временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Например, время генерации кишечных палочек в оптимальных условиях составляет около 20 мин. Продолжительность периода зависит от вида бактерии, ее возраста, характера среды, условий культивирования и т. п.

Теоретически вычислено, что при делении клетки через каждые 20-30 мин количество бактерий за 24 ч составило бы 10-15 млрд. клеток, а через 5 сут. размножения одна клетка дала бы такую живую массу потомства, которая заполнила бы собой бассейны морей и океанов нашей планеты. Однако в действительности такого быстрого размножения микробов не происходит, так как в естественных условиях отрицательно влияют на размножение накапливающиеся продукты метаболизма, ультрафиолетовые лучи, низкая и высокая температуры внешней среды и др.

Рост микроорганизмов в жидкой питательной среде может проявляться помутнением и изменением цвета среды, наличием или отсутствием пристеночного кольца и поверхностной пленки различного характера, наличием или отсутствием осадка. При выращивании на обезжиренном молоке молочнокислые бактерии вызывают в первые сутки культивирования свертывание молока с образованием однородного плотного сгустка без обильного выделения молочной сыворотки и газа, с кисломолочными вкусом и запахом.

При размножении на плотных питательных средах микроорганизмы образуют колонии (от nar.colonia - поселение), которые представляют собой видимые скопления особей одного вида и формирующиеся в результате размножения, как правило, одной клетки. Они бывают круглой, розеткообразной, звездчатой, древовидной формы, могут иметь поверхность гладкую, выпуклую, плоскую, куполообразную, вдавленную. Колонии отмечаются также по строению края, который, может быть ровным (S-форма) и шероховатым (R-форма). По величине колонии подразделяют на крупные (свыше 4 мм) в диаметре, средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1мм).

Колонии отличаются также по консистенции, плотности, прозрачности, цвету. Они бывают слизистыми, сметанообразными, влажными, сухими, прозрачными, полупрозрачными и непрозрачными, окрашенными и бесцветными. Различные виды микроорганизмов образуют специфические колонии на плотных питательных средах и дают характерный рост на жидких средах. Особенности роста микробов на питательных средах называют культуральными свойствами. Их учитывают при определении видов микроорганизмов.

3. Какова роль микроорганизмов в жизни человека?

Ответ. Жизнедеятельность микроорганизмов – необходимое условие существования на Земле органического мира. Благодаря деятельности микробов осуществляется минерализация органических остатков, что обеспечивает непрерывное поступление в атмосферу углекислоты, без которой невозможен фотосинтез растениями. Они принимают самое активное участие в различных геологических процессах. Выветривание горных пород, формирование почв, образование селитры, различных руд (в том числе серных), известняков, нефти, каменного угля, торфа – все эти и многие другие процессы протекают при непосредственном участии микроорганизмов.

Со многими микробами люди сталкиваются с очень давних времен: при закваске теста, изготовлении кисломолочных продуктов, пива, вина, уксуса и пр. Микроорганизмы участвуют в процессах самоочищения окружающей среды. Их жизнедеятельность лежит в основе промышленных процессов, связанных с выпуском антибиотиков, витаминов, стимуляторов роста, кормов для скота и пр.

С помощью микроорганизмов из шлама можно извлекать полезные ископаемые, предотвращать опасность взрыва гремучего глаза в шахтах и т.д.

В подавляющем большинстве микробы или безвредны, или приносят пользу и становятся активными помощниками человека.

Без преувеличения можно сказать, что польза, какую приносят микроорганизмы, значительно больше, чем вред, который они причиняют.

Однако, как правило, при обычных ситуациях мы забываем об этом. И очень часто, когда говорим о микробах, вспоминаем прежде всего болезнетворных, потому что очень трудно забыть страх перед невидимыми возбудителями многих болезней.

На протяжении миллионов лет макро- и микроорганизмы взаимно приспосабливались и стали необходимыми друг другу. Микробы – нормальные обитатели организма человека или животного стали неотъемлемыми спутниками макроорганизма и играют значительную роль в их жизни. Так представители нормальной микрофлоры кишечника завершают переваривание питательных веществ, способствуют более эффективному их использованию макроорганизмом. Многие микробы, обитающие в кишечнике, являются антагонистами гнилостных и болезнетворных бактерий, а также вырабатывают витамины, которые используются организмом человека или животного.

Нормальная микрофлора человека и животного – необходимое условие сохранения здоровья макроорганизма. Нарушение микробных биоценозов в разных органах и системах организма ведет к развитию патологических процессов, снижению активности защитных сил организма, развитию дисбактериоза. Если новорожденного выращивать в стерильных условиях, кормить стерильной пищей, т.е. лишить его нормальной микрофлоры, он будет плохо развиваться, отстанет в росте и может погибнуть.

Вопросы после § 67

1. Для получения каких видов продукции человек использует микроорганизмы?

Ответ. К микроорганизмам относят всех прокариот, а из эукариот – простейших, микроскопические формы грибов и водорослей. Все они находят широкое применение в промышленности, сельском хозяйстве, медицине и энергетике. Роль микроорганизмов в производстве лекарств, биологически активных соединений, кормовых добавок, бактериальных удобрений, в хлебопечении, виноделии, в производстве многих молочных продуктов невозможно переоценить. В связи с этим постоянно ведется поиск новых высокопродуктивных штаммов микроорганизмов.

2. Чем селекция микроорганизмов отличается от селекции растений и животных?

Ответ. От методов селекции высших эукариот они отличаются существенно. До недавнего времени основными методами получения высокопродуктивных штаммов микроорганизмов были искусственный мутагенез и последующий отбор групп генетически идентичных клеток – клонов. После выделения из дикого штамма микроорганизмов, обладающих полезными для человека свойствами, проводится отбор наиболее продуктивных штаммов среди них. Следующий этап, как правило, – применение искусственного мутагенеза, позволяющего усилить появление различных мутаций. В качестве мутагенов используются ионизирующие излучения, некоторые химические вещества, а также ультрафиолетовое излучение, обладающее хотя и низкой проникающей способностью, но достаточной для появления мутаций у микроорганизмов. Вероятность возникновения мутаций у микроорганизмов та же, что и у всех других организмов, – примерно 1 мутация на 1 млн особей по каждому гену. Однако, учитывая то, что получить миллионное и миллиардное потомство у микроорганизмов нетрудно, вероятность выделения мутаций по данному гену достаточно высокая.

Для получения культуры микроорганизмов – мутантов с нужными качествами учеными-селекционерами разработаны специальные методы отбора. Отобранный клон подвергается многократному пересеву на питательную среду с контролем на образование требуемого продукта. Цель такого многократного клонирования – получение наиболее однородной популяции клеток. После получения продуктивных штаммов приступают к их размножению. Использование данной технологии позволило селекционерам получить штаммы, продуктивность которых в сотни и тысячи раз выше по сравнению с исходными штаммами микроорганизмов, взятыми из природы.

3. Какие методы используются в селекции микроорганизмов?

Ответ. Продуктивность диких форм бактерий невысокая, поэтому человек совершенствует и выводит новые штаммы.

В селекции микроорганизмов применяют традиционные и новейшие методы. К традиционным методам относят экспериментальный мутагенез и отбор по продуктивности. Экспериментальный мутагенез - это воздействие на организм различных мутагенов с целью получения мутации. Этот метод имеет свои особенности при селекции бактерий:

- у селекционера имеется неограниченное количество материала для работы: за считанные дни в чашках Петри или пробирках на питательных средах можно вырастить бактерий

- значительно меньшее количество генов, их генетическая регуляция более простая, взаимодействия генов просты или отсутствуют миллиарды клеток;

- более эффективное использование мутационного процесса, поскольку геном микроорганизмов гаплоидный, что позволяет выявить любые мутации уже в первом поколении;

- простота генетической организации

Но возможности традиционной селекции ограничены. Успехи же таких наук как молекулярная биология и генетика в изучении микроорганизмов, а так же возрастающие потребности практического использования микробных продуктов привели к созданию новейших методов целенаправленного и контролируемого получения микроорганизмов с заданными свойствами.

К новейшим методам селекции относят генную инженерию. В генной инженерии используют два способа:

- выделение нужного гена из генома одного организма и внедрение его в геном бактерий;

- синтез искусственным путем гена и внедрение его в геном бактерий.

4. В чем особенности методов генной инженерии?

Ответ. Успехи, достигнутые молекулярной биологией и генетикой в изучении микроорганизмов, а также ограниченность возможностей традиционной селекции привели к созданию новых методов целенаправленного и контролируемого получения микроорганизмов с заданными свойствами.

В основе этих технологий лежат приемы генной инженерии. Они позволяют выделять необходимый ген и вводить его в новое генетическое окружение с целью создания организма с новыми, заранее предопределенными признаками.

Методы генной инженерии остаются еще очень сложными и дорогостоящими. Но уже сейчас с их помощью в промышленности получают такие важные медицинские препараты, как интерферон, гормоны роста, инсулин и другие.

5. Какие перспективы открывают методы генной инженерии в селекции микроорганизмов?

Ответ. Для того чтобы обеспечить себя доброкачественной пищей и сырьем и при этом не привести планету к экологической катастрофе, человечеству необходимо научиться эффективно изменять наследственную природу живых организмов. Поэтому не случайно главной задачей селекционеров в наше время стало решение проблемы создания новых форм растений, животных и микроорганизмов, хорошо приспособленных к индустриальным способам производства, устойчиво переносящих неблагоприятные условия, эффективно использующих солнечную энергию и, что особенно важно, позволяющих получать биологически чистую продукцию без чрезмерного загрязнения окружающей среды. Принципиально новыми подходами к решению этой фундаментальной проблемы является использование в селекции генной и клеточной инженерии. Генная (генетическая) инженерия. Это раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине и осуществлять контроль за синтезом конечных продуктов метаболизма. Возникнув на стыке химии нуклеиновых кислот и генетики микроорганизмов, генная инженерия занимается расшифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, встраиванием выделенных из клеток живых организмов или вновь синтезированных генов в клетки растений и животных с целью направленного изменения их наследственных свойств. Для осуществления переноса генов (или трансгенеза) от одного вида организмов в другой, отдаленный по своему происхождению, необходимо выполнить несколько сложных операций:

• выделение генов (отдельных фрагментов ДНК) из клеток бактерий, растений или животных. В отдельных случаях эту операцию заменяют искусственным синтезом нужных генов;

• соединение (сшивание) отдельных фрагментов ДНК любого происхождения в единую молекулу в составе плазмиды;

• введение гибридной плазмидной ДНК, содержащей нужный ген, в клетки хозяина;

• копирование (клонирование) этого гена в новом хозяине с обеспечением его работы.

Клонированные гены путем микроинъекции вводят в яйцеклетку млекопитающих или протопласты растений (изолированные клетки, лишенные ферментативной обработкой клеточной стенки) и из них выращивают целых животных или растения, в геном которых встроены клонированные гены. Растения и животные, геном которых изменен путем генноинженерных операций, получили название трансгенных растений или трансгенных животных. Уже получены трансгенные мыши, кролики, свиньи, овцы, в геноме которых работают чужеродные гены различного происхождения, в том числе гены бактерий, дрожжей, млекопитающих, человека; а также трансгенные растения с генами других, неродственных видов. Трансгенные организмы свидетельствуют о больших возможностях генной инженерии как прикладной ветви молекулярной генетики. Например, в последние годы получено новое поколение трансгенных растений, для которых характерны такие ценные признаки, как устойчивость к гербицидам, к атаке насекомых и др. Есть все основания предполагать, что уже в ближайшем будущем будет решена проблема направленного изменения наследственности высших растений, что приведет к революции в сельском хозяйстве. В первую очередь речь пойдет о создании симбиоза между злаками и азотфиксирующими клубеньковыми бактериями, а это решит проблему азотных удобрений. Разрабатывается метод переноса в определенные растения более эффективных ферментативных систем метаболического пути фиксации атмосферного углерода (темновой фазы фотосинтеза, или цикла Кальвина), что позволит повысить скорость фиксации СO2 и продуктивность фотосинтеза культурных растений. Важным шагом к победе не только над генетическими болезнями, но и над старостью будут получение векторов, безопасных для клетки, и окончательная разгадка механизма активации, «включения и выключения» генов. Тогда у врачей появится возможность заменять в организме пожилых людей поврежденные в результате мутаций гены на нормальные. Хромосомная инженерия растений основывается на возможности замены отдельных хромосом или даже их фрагментов на сестринские от другого генотипа этого же или иного вида. Доказано, что некоторые фрагменты хромосом донора могут при соответствующих условиях встраиваться в хромосомы реципиента. Решение проблемы целенаправленного переноса участков хромосом может оказать революционное влияние на процесс селекции по двум причинам:

• для такого переноса можно использовать естественные механизмы, созданные природой;

• получать фрагменты хромосом значительно легче, чем выделять отдельные гены и пытаться встраивать их в геном реципиента.

Клеточная инженерия основана на использовании методов культивирования изолированных клеток и тканей на искусственной питательной среде в экспериментальных условиях. Этот метод основан на способности растительных клеток в результате регенерации формировать целое растение из единичной клетки. Условия регенерации разработаны для многих культурных растений: картофеля, пшеницы, ячменя, кукурузы, томата и др. Работа с этими объектами делает возможным использование в селекции нетрадиционных методов клеточной инженерии, таких, как соматическая гибридизация, гаплоидия, клеточная селекция, преодоление нескрещиваемости в культуре и др. Соматическая гибридизация — это слияние двух различных клеток в культуре тканей. Сливаться могут разные виды клеток одного организма и клетки разных, иногда очень далеких видов, например: мыши и крысы, кошки и собаки, человека и мыши. Очень важное направление клеточной инженерии связано с ранними стадиями эмбриогенеза. Например, оплодотворение яйцеклеток в пробирке уже сейчас позволяет преодолевать некоторые распространенные формы бесплодия у человека. У сельскохозяйственных животных с помощью инъекции гормонов удается получить от одной коровы-рекордистки десятки яйцеклеток, оплодотворить их в пробирке спермой породистого быка, а затем имплантировать в матку других коров и таким путем получить от одного ценного экземпляра в 10 раз больше потомства, чем это было возможно обычным путем. Культуру растительных клеток выгодно использовать для быстрого размножения медленно растущих растений: женьшеня, маслинной пальмы, малины, персиков и др. Так, при обычном разведении куст малины может дать не более 50 отростков и год, в то время как с помощью культуры клеток можно получить более 50 тыс. растений. При таком разведении иногда возникают растения более продуктивные, чем исходный сорт. Так были получены новые ценные сорта картофеля и грейпфрута.