§ 26. Матричный синтез ДНК

Ст. 141

Вспомните, в чем заключается принцип комплиментарности. Какие нуклеотиды в молекуле ДНК комплементарны друг другу? При помощи каких связей нуклеотиды соединяются в двойную спираль молекулы ДНК?

Принцип комплиментарности – это биологический закон, согласно которому пурины (молекулы, химический каркас которых включает 3 углеродных кольца, в ДНК и РНК это аденин и цитозин) взаимодействуют только с пиримидинами (у них 2 углеродных кольца, в ДНК это тимин и гуанин, а в РНК – урацил).

Принцип комплиментарности обусловлен химическим строением азотистых оснований:

Аденин (А) – тимин (Т)

Цитозин (Ц) – гуанин (Г)

Нуклеотиды соединяются в двойную спираль молекулы ДНК с помощью водородных связей.

Ст. 144

1. Опишите процесс репликации ДНК. Почему синтез молекулы ДНК идёт фрагментарно, а не целиком по всей длине?

Репликация ДНК – ключевое событие в ходе деления клетки. Принципиально, чтобы к моменту деления ДНК была реплицирована полностью и при этом только один раз. Это обеспечивается определёнными механизмами регуляции репликации ДНК. Репликация проходит в три этапа:

инициация репликации

элонгация

терминация репликации.

Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много. С понятием сайта инициации репликации тесно связано понятиерепликон. Репликон – это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий, как правило, представляют собой один репликон, это значит, что репликация всего генома является следствием всего одного акта инициации репликации. Геномы эукариот (а также их отдельные хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значительно сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы. Молекулярные механизмы, которые контролируют количество актов инициации репликации в каждом сайте за один цикл деления клетки, называются контролем копийности. В бактериальных клетках помимо хромосомной ДНК часто содержатся плазмиды, которые представляют собой отдельные репликоны. У плазмид существуют свои механизмы контроля копийности: они могут обеспечивать синтез как всего одной копии плазмиды за клеточный цикл, так и тысяч копий.

Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка – место непосредственной репликации ДНК. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация одно — или двунаправленной. Более распространена двунаправленная репликация. Через некоторое время после начала репликации в электронный микроскоп можно наблюдать репликационный глазок – участок хромосомы, где ДНК уже реплицирована, окружённый более протяжёнными участками нереплицированной ДНК.

В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс (реплисома), ключевым ферментом которого является ДНК — полимераза. Репликационная вилка движется со скоростью порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту у прокариот и 500–5000 – у эукариот.

Молекулярный механизм репликации

Ферменты (хеликаза, топоизомераза) и ДНК — связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК — полимеразы, способной распознать и исправить ошибку. Репликация у эукариот осуществляется несколькими разными ДНК — полимеразами. Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципусуперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК. Синтез энергозатратный.

Цепи молекулы ДНК расходятся, образуют репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле.

2. Какой фермент участвует в синтезе дочерних цепей ДНК?

ДНК — полимеразы (подбирают дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и комплементарно присоединяют их к матричной цепи ДНК);

РНК — праймазы (образуют РНК — затравки, праймеры);

ДНК — лигазы (сшивают фрагменты ДНК).

3. Постройте вторую цепь ДНК, если первая цепь имеет следующую последовательность нуклеотидов: ЦТТААЦАЦЦГГГЦАТТЦЦГГГЦААТТГ.

Вторая цепь:ГААТТГТГГЦЦЦГТААГГЦЦЦГТТААЦ.

4. Используя дополнительную информацию, ответьте на вопрос: каким методом удалось доказать полуконсервативный принцип репликации?

Согласно гипотезе Уотсона — Крика, каждая из цепей двойной спирали ДНК служит матрицей для репликации комплементарных дочерних цепей. При этом образуются две дочерние двухцепочечные молекулы ДНК, идентичные родительской ДНК. Каждая из этих молекул содержит одну неизмененную цепь родительской ДНК и одну вновь синтезированную цепь дочерней ДНК.

Гипотеза Уотсона — Крика была проверена с помощью опытов, выполненных М.Мезельсоном и Ф.Сталем в 1957 г. Клетки E.coli выращивали в течение ряда поколений в среде, содержащей в качестве источника азота хлористый аммоний NH4Cl, в котором обычный изотоп [14N] был заменен на «тяжелый» изотоп [15N]. Вследствие этого все соединения клеток, имеющие в своем составе азот, в том числе и азотистые основания ДНК, оказались обогащенными изотопом [15N]. Плотность ДНК, выделенной из этих клеток, была выше плотности нормальной [14N] ДНК. Смесь «тяжелой» [15N] и «легкой» [14N] ДНК удалось разделить методом центрифугирования в концентрированном растворе хлористого цезия. Поскольку [15N] ДНК чуть тяжелее, чем [14N] ДНК, полоса, в которой она достигает равновесия в градиенте СsCl, расположена ближе ко дну пробирки, чем полоса с [14N] ДНК.

Мезельсон и Сталь перенесли клетки E.coli, росшие на среде с изотопом [15N] и содержащие «тяжелые» цепи ДНК, на свежую среду с обычным изотопом [14N]. На этой среде клетки E.coli выращивали в течение времени, необходимого для удвоения клеток. Затем из этих клеток выделяли ДНК и анализировали ее плотность с помощью описанного выше метода седиментации (осаждения ДНК в растворе СsCl). В градиенте СsCl была обнаружена лишь одна полоса ДНК, плотность которой оказалась средней между плотностью нормальной «легкой» [14N] ДНК и плотностью «тяжелой» [15N] ДНК. Это подтвердило, что двухцепочечная ДНК дочерних клеток содержит одну старую 15N – цепь от родительской ДНК и одну новую 14N – цепь.

Если выделить ДНК из клеток, которые прошли два цикла удвоения на среде с [14N], то она разделится на две полосы: одна с плотностью, соответствующей плотности нормальной «легкой» ДНК, а другая с плотностью «гибридной» ДНК, наблюдавшейся после первого удвоения клеток. На основании этих данных Мезельсон и Сталь пришли к выводу, что в строгом соответствии с гипотезой Уотсона — Крика каждый дочерний дуплекс ДНК после двух циклов удвоения клеток содержал одну родительскую и одну новообразованную цепь ДНК. Такой механизм репликации назвали полуконсервативным. Полученные результаты полностью исключили консервативный способ репликации, при котором одна дочерняя ДНК должна была бы содержать обе исходные цепи, а другая состояла бы из двух новосинтезированных цепей. Опыт Мезельсон и Сталя позволил также отвергнуть дисперсивный механизм репликации, при котором каждая дочерняя цепь ДНК состоит из коротких участков как родительской, так и новообразованнй ДНК, соединенных между собой случайным образом.